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【介紹】

金屬離子是人體內(nèi)重要的微量元素，直接影響人體的新陳代謝和受損組織的再生。例如，鎂離子(Mg2+)與骨修復(fù)材料的先進(jìn)結(jié)合，使復(fù)合材料具有促進(jìn)血管修復(fù)和增強(qiáng)成骨細(xì)胞粘附的功能。

【摘要】

最近，受磁鐵吸引金屬的啟發(fā)，同濟(jì)大學(xué)蔡明副教授/上海交通大學(xué)崔文國(guó)教授團(tuán)隊(duì)共同利用金屬離子配體的配位反應(yīng)構(gòu)建了雙膦酸鹽功能化可注射水凝膠微球(GelMA-BP-Mg)，該微球可以通過(guò)捕獲 Mg2+ 促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨缺損的松質(zhì)骨重建。通過(guò)在 GelMA 微球上接枝雙膦酸鹽 (BP)，GelMA-BP 微球可以通過(guò)配位反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)大的 Mg2+ 捕獲能力和緩釋性能，而緩釋 BP 具有骨靶向特性。在可注射的 GelMA-BP-Mg 微球系統(tǒng)中，捕獲的 Mg2+ 的原子百分比為 0.6%，捕獲的 Mg2+ 可以有效釋放 18 天。

這些證明復(fù)合微球能夠有效地捕獲Mg2+，為復(fù)合微球激活成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞并抑制破骨細(xì)胞提供了基礎(chǔ)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磁鐵激發(fā)的Mg2+捕獲復(fù)合微球通過(guò)刺激成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)抑制破骨細(xì)胞，有利于成骨和血管生成，最終有效促進(jìn)松質(zhì)骨再生。該研究可為基于金屬離子治療骨質(zhì)疏松性骨缺損提供一些有意義的思路。相關(guān)論文以題為Capturing Magnesium Ions via Microfluidic Hydrogel Microspheres for Promoting Cancellous Bone Regeneration發(fā)表在《ACS Nano》上。

【圖文解析】

受磁鐵吸引金屬的自然現(xiàn)象啟發(fā)，團(tuán)隊(duì)通過(guò)席夫堿反應(yīng)和配位鍵在甲基丙烯腈?；髂z(GelMA-BP)微球表面螯合Mg2+，以構(gòu)建一種捕獲 Mg2+ 微流體水凝膠微球(GelMA-BP-Mg)受磁鐵啟發(fā)，賦予水凝膠微球主動(dòng)捕獲 Mg2+、微創(chuàng)注射性、持續(xù)緩釋特性和骨靶向能力，從而增強(qiáng)其激活成骨細(xì)胞和 內(nèi)皮細(xì)胞和抑制破骨細(xì)胞，最終通過(guò)“集成多用途”微球?qū)崿F(xiàn)松質(zhì)骨的重建(示意圖1)。

示意圖 1. (A) 微流體 GelMA-BP 微球的制備過(guò)程和捕獲 Mg2+的 GelMA-BP-Mg 微球的構(gòu)建。(B) 具有“磁鐵”功能的可捕獲Mg2+的微流控GelMA-BP-Mg微球的構(gòu)建及捕獲Mg2+的原理描述。

復(fù)合微球的制備與表征

SEM顯示GelMA-BP-Mg微球表面存在平均粒徑為79±15nm的BP-Mg納米顆粒，而GelMA-BP和GelMA微球表面不存在這種納米結(jié)構(gòu)(圖1A)。能量色散 X 射線光譜 (EDS) 顯示 GelMA-BP 微球具有均勻的 P 元素分布，GelMA-BP-Mg 微球具有均勻的鎂元素分布(圖 1B)。此外，對(duì)于每組復(fù)合微球樣品，EDS 顯示SEM 觀察到的 GelMA-BP 和 GelMA-BP-Mg 中存在相應(yīng)的 P 元素和 Mg 元素(圖 1C)。31P NMR譜(圖1D)顯示只有GelMA-BP和GelMA-BP-Mg在17.6ppm處有明顯的共振峰。圖1E顯示了BP的累積釋放曲線。可以觀察到，在 GelMA-BP 和 GelMA-BP-Mg 微球藥物釋放后的 12 天內(nèi)，BP 的釋放速度較快，然后逐漸減慢。發(fā)布21天后，BP的發(fā)布趨于持平。圖 1F 顯示了 GelMA-BP-Mg 微球的 Mg2+ 累積釋放曲線。圖 1G 顯示系統(tǒng)中形成粒徑為 77±12 nm 的 BP-Mg 納米粒子，與圖 1G 中 SEM 顯示的 GelMA-BP-Mg 微球表面納米粒子基本相同。圖 1H 顯示了制備可捕獲 Mg2+ 的復(fù)合微球所涉及的化學(xué)方程式。

圖 1. 復(fù)合微球的特性。(A) GelMA、GelMA-BP 和 GelMA-BP-Mg 微球在不同放大倍數(shù)下的典型掃描電子顯微鏡圖像。(B) 雙膦酸鹽在 GelMA-BP 微球上的均勻分布以及雙膦酸鹽和捕獲的 Mg2+ 在 GelMA-BP-Mg 微球上的均勻分布。(C) 能譜分析，證實(shí)復(fù)合微球上存在相應(yīng)的 P 和 Mg 元素。(D) 三種復(fù)合微球的 31P 核磁共振譜。(E, F) 復(fù)合微球 BP 和 Mg2+ 的釋放曲線，證明了 BP 的成功接枝和 Mg2+ 的有效捕獲。(G) MgCl2 溶液、BP 溶液以及 MgCl2 和 BP 混合體系的 TEM 圖像。(H) 制備可捕獲 Mg2+的復(fù)合微球所涉及的化學(xué)方程式。

復(fù)合微球體外生物相容性

首先在24孔板中培養(yǎng)BMSCs和HUVECs細(xì)胞，然后用GelMA、GelMA-BP、GelMA-BP-Mg微球共培養(yǎng)BMSCs和HUVECs細(xì)胞。根據(jù) 1、3 和 5 天的活/死染色結(jié)果，復(fù)合微球?qū)才囵B(yǎng)的 BMSC 和 HUVEC 的毒性較小(圖 2AB、DE)。此外，CCK-8 結(jié)果進(jìn)一步定量驗(yàn)證了每組之間的細(xì)胞增殖活性(圖 2C、F)。定量統(tǒng)計(jì)分析表明復(fù)合微球具有良好的生物相容性。圖 3 和圖 S5A、B 的面板 A-E 是 BMSCs 和 HUVECs 細(xì)胞與 GelMA、GelMA-BP 和 GelMA-BP-Mg 微球共培養(yǎng) 2、5 和 7 天的結(jié)果，以及定量分析 進(jìn)行了細(xì)胞數(shù)。因此，這些結(jié)果表明，每組復(fù)合微球都具有良好的生物相容性。

圖 2. 復(fù)合微球的細(xì)胞生物相容性。(A、D) BMSCs 和 HUVEC 細(xì)胞與復(fù)合微球共培養(yǎng) 1、3 和 5 天，通過(guò)活/死染色進(jìn)行分析?；罴?xì)胞是綠色的，死細(xì)胞是紅色的。(B, E) 兩種細(xì)胞存活率的統(tǒng)計(jì)。(C, F) CCK-8 檢測(cè)到這些復(fù)合微球的毒性。

圖 3. 復(fù)合微球的生物相容性。(A, B) BMSCs 和 HUVECs 細(xì)胞在復(fù)合微球上的增殖行為，觀察了 2、5 和 7 天。(C)復(fù)合微球和細(xì)胞的共培養(yǎng)。紅色顯示骨架;藍(lán)色顯示核。(D)微球上細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)。

成管實(shí)驗(yàn)

圖 4A 顯示，在給定的時(shí)間點(diǎn)，HUVEC 在每組復(fù)合微球樣品的提取物中培養(yǎng)。3小時(shí)和6小時(shí)后，GelMA-BP-Mg組的管形成更好，與GelMA-BP和GelMA組形成鮮明對(duì)比，表明復(fù)合微球釋放的Mg具有一定的血管生成活性。ImageJ 用于計(jì)算結(jié)的數(shù)量和形成的管的總長(zhǎng)度。因此，結(jié)果表明，GelMA-BP-Mg 組的這些計(jì)算參數(shù)高于 GelMA-BP 和 GelMA 組，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 4B、C)。

圖 4. 復(fù)合微球的體外血管化、體外礦化和破骨細(xì)胞抑制。(A) 經(jīng)過(guò) 1、3 和 6 小時(shí)的培養(yǎng)，HUVEC 細(xì)胞形成內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)。(B, C) 分析組間總長(zhǎng)度 (B) 和節(jié)點(diǎn)數(shù) (C) 的差異。(D) 不同微球復(fù)合物的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用茜素紅 S 染色的照片。(E) 不同微球復(fù)合物中破骨細(xì)胞的 TRAP 染色顯微鏡圖片。(F, G) 不同組茜素紅 S 染色和 TRAP 染色的定量分析。

Q-PCR 和蛋白質(zhì)印跡評(píng)估

培養(yǎng) 24 小時(shí)后，GelMA-BP-Mg 組中 VEGF 和 e-NOS 的表達(dá)水平顯著高于 GelMA-BP 和 GelMA 組(圖 5A、B、E-G)。因此，這些結(jié)果證明團(tuán)隊(duì)的復(fù)合GelMA-BP-Mg 微球可以有效地釋放 Mg2+以激活 e-NOS 和 VEGF 途徑，從而促進(jìn)血管再生。

圖 5. 復(fù)合微球?qū)?BMSCs 和 HUVECs 細(xì)胞中成骨基因和管基因表達(dá)的影響。(A-D) Q-PCR 顯示相關(guān)的 mRNA 表達(dá)。這些基因包括 Runx2、ALP、VEGF 和 e-NOS。(E-I) 蛋白質(zhì)印跡探索蛋白質(zhì)表達(dá)并進(jìn)行定量分析。

復(fù)合微球體內(nèi)骨再生評(píng)估和體內(nèi)Mg2+捕獲性能

如圖 6A 所示，sham 組和 GelMA 組在 4 周和 8 周后沒(méi)有明顯的骨再生，而 GelMA-BP 和 GelMA-BP-Mg 的骨質(zhì)量有一定程度的改善。最后，注射 GelMA-BP-Mg 的骨骼的 Tb.Th、BV/TV 和 BMD 顯著高于 GelMA 和 GelMA-BP 組(圖 6B-H)。EDS 顯示從骨缺損中獲得的 GelMA-BP 微球在 1 周和 2 周后在表面具有 Mg2+ 分布(圖 6I)。因此，結(jié)果證明 GelMA-BP 微球仍然可以有效地捕獲體內(nèi)的 Mg2+。

圖 6. Micro-CT 評(píng)估了可注射復(fù)合微球?qū)w內(nèi)骨再生的影響。(A-C) 骨質(zhì)疏松大鼠模型成功建立和定量分析。4 周和 8 周時(shí)骨質(zhì)疏松性骨缺損大鼠股骨遠(yuǎn)端的典型顯微 CT 圖像。(E-H) 不同治療組微 CT 參數(shù)的定量分析：(E) Bv/Tv、(F) Tb.Sp、(G) BMD 和 (H) Tb.Sp。(I) GelMA-BP微球注入骨缺損1周和2周后，EDS顯示微球表面Mg2+分布，證明GelMA-BP微球可有效捕獲體內(nèi)Mg2+。

組織學(xué)評(píng)估

HE染色進(jìn)一步驗(yàn)證了復(fù)合微球促進(jìn)松質(zhì)骨再生的能力(圖7A、B)。CD31免疫熒光用于測(cè)試每組的第四周切片(圖7C，D)。團(tuán)隊(duì)還通過(guò)I型膠原蛋白的免疫組織化學(xué)染色對(duì)骨缺損處新形成的骨組織進(jìn)行了組織學(xué)分析(圖7E，G)，和結(jié)果與其他研究相似。定量分析結(jié)果顯示，對(duì)照組骨缺損仍較明顯，而注射GelMA-BP和GelMA-BP-Mg微球組的松質(zhì)骨重建較多。特別是注射GelMA-BP-Mg微球的大部分缺陷都可以治愈。因此，微球復(fù)合物具有優(yōu)異的成骨作用，與 GelMA-BP 和 GelMA 相比，GelMA-BP-Mg 具有更強(qiáng)的松質(zhì)骨再生能力。

圖 7. 復(fù)合微球體內(nèi)治療的組織學(xué)分析。(A)每組治療 8 周的骨組織切片 HE 染色的代表性圖片。(B)不同組中小梁骨面積的百分比。(C)手術(shù)后 8 周拍攝的股骨組織切片的代表性圖片，用于I型膠原蛋白的免疫組織化學(xué)染色。(D) I 型膠原陽(yáng)性細(xì)胞的定量。(E, F) 每組 CD31 表達(dá)變化的免疫熒光染色，以及蛋白質(zhì)表達(dá)差異的量化。

【總結(jié)】

受磁鐵吸引金屬的自然現(xiàn)象的啟發(fā)，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)席夫堿反應(yīng)性和配位鍵螯合了接枝BP的GelMA-BP微球表面的Mg2+。因此，構(gòu)建了一種具有“磁鐵”功能的可捕獲Mg2+的微流控GelMA-BP-Mg微球，賦予水凝膠微球主動(dòng)捕獲Mg2+、微創(chuàng)注射性、持續(xù)緩釋特性和骨靶向能力，從而增強(qiáng)其激活成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及抑制破骨細(xì)胞的能力，最終通過(guò)“一體化多用途”微球?qū)崿F(xiàn)松質(zhì)骨的重建。顯然，在 GelMA 微球上接枝 BP 使 GelMA-BP 微球具有強(qiáng)大的 Mg2+捕獲性能和緩釋性能。GelMA-BP-Mg 復(fù)合微球在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出優(yōu)異的 Mg2+捕獲和釋放性能、血管化能力、成骨潛力和破骨細(xì)胞抑制能力。進(jìn)一步證明捕獲Mg2+的復(fù)合微球可促進(jìn)大鼠骨缺損處松質(zhì)骨的再生。團(tuán)隊(duì)相信這種基于“磁鐵”這一自然現(xiàn)象能夠捕獲Mg2+的復(fù)合微球，將為臨床骨質(zhì)疏松性骨缺損修復(fù)提供一個(gè)有意義的概念。

參考文獻(xiàn)：

doi.org/10.1021/acsnano.1c02147